20世纪30年代末期，弗莱明把青霉菌提供给了澳大利亚裔英国病理学家弗洛里和德国生物化学家鲍里斯·钱恩。通过一段时间的实验，弗洛里和钱恩终于用冷冻干燥法提取了青霉素晶体。之后，弗洛里在一种甜瓜上发现了一种霉菌，这种霉菌可供大量提取青霉素，并且，他还用玉米粉调制出了相应的培养液。1940年，弗洛里和钱恩用青霉素重新做了实验。他们给8只小鼠注射了致死剂量的链球菌，然后给其中的4只用青霉素治疗。几个小时内，只有用青霉素治疗过的4只小鼠还健康活着。这一实验揭开了青霉素用于临床的序幕，此后一系列临床实验证实了青霉素对多种细菌感染有惊人疗效。
在这些研究成果的推动下，1942年，美国制药企业开始大批量生产青霉素。1943年，英国和美国正在与德国交战，这种新的药物被用于战争的伤员上，结果青霉素的确对控制伤口感染非常有效。1944年，普通公民也在医疗中使用了青霉素。1945年第二次世界大战结束时，青霉素的使用已遍及全世界。同年，弗莱明、弗洛里和钱恩因“发现青霉素及其临床效用”而共同荣获诺贝尔生理学或医学奖。
